Biomembranas, Autoensamble

 Membranas biológicas y autoensamble

Como vimos en el blog de tensión superficial, en la superficie las moléculas de soluto se encuentran en mayor proporción que en el resto de la solución, a la que llamamos bulk, esto es más pronunciado en aquellas moléculas que tienden a colocarse en la superficie entre el agua y el aire. Estas moléculas tienen una porción que repele el agua (hidrofóbica) y una proporción que puede quedarse en el agua (hidrofílica). A estas moléculas que poseen porciones hidrofóbicas e hidrofílicas, se les llama anfipáticas. Son parcialmente solubles en agua, y parcialmente solubles en solventes orgánicos como el hexano o el cloroformo. Pertenecen al grupo de biomoléculas llamados Lípidos. OJO, no todos los lípidos son anfipáticos, pero sí virtualmente todas las moléculas anfipáticas entran en alguna clasificación de lípidos.

Antes de hablar más de los lípidos, hablemos de las moléculas anfipáticas. Te podrás imaginar que como en sí mismas tienden a colocarse en la interfase entre el agua y el aire (o cualquier otra solución hidrofóbico), disminuyen la tensión superficial del agua, razón por la cual se llaman tensoactivos (tensioactivo) o surfactantes. La disminución de la tensión superficial permite que el agua pueda "humedecer" más superficies que no son hidrofílicas, por lo que pueden funcionar como "detergentes" para "solubilizar" grasa o compuestos grasosos en agua.

Las moléculas anfipáticas se disuelven cuando están a baja concentración, pero a medida que la concentración se incrementa, la interacción con el agua en la parte hidrofóbica hace que se separen hasta saturar la superficie y si se supera cierta concentración empiezan a auto-ensamblarse en estructuras características. A estas estructuras se les llama auto-ensambladas, una de las más conocidas son las micelas, cuya superficie es hidrofílica y el interior es hidrofóbico.

Nota, que las moléculas del tensoactivo -que en este diagrama parecen cerillas/cerillos/fósforos-, cuando se disuelven a baja concentración se disponen por una parte, en la interfase aire-agua con la parte hidrofílica hacia el agua y la parte hidrofóbica hacia el aire, formando una película, y por otra parte,  también dentro del agua "bulk" estarán disueltas solas a las que llamamos monómeros. Cuando la concentración se incrementa, el número de monómeros se incrementa. A concentraciones mayores, se generan las estructuras autoensambladas.

Los monómeros presentan las mismas propiedades coligativas como cualquier otro soluto, pero las estructuras autoensambladas no, porque en realidad ya no están disueltas, sino dispersas. Recuerda la definición de solución, mezcla homogénea transparente con los solutos separados a nivel molecular. Una estructura autoensamblada, dímeros u oligómeros ya no constituyen una solución. 

De esta manera, se llega a una concentración a partir de la cual, ya no se observa un cambio en propiedades coligativas (como presión de vapor, presión osmótica) aunque se incremente la concentración de la molécula anfipática. Esto se debe a que, por más que se agregue más soluto, la concentración de monómeros ya no se incrementa, pues todas las moléculas van a "organizarse" en estructuras autoensambladas. A esta concentración, se le llama concentración micelar crítica (CMC).

Figura tomada de Jyrkorpela - Own work, CC BY-SA 4.0, https://commons.wikimedia.org/w/index.php?curid=85468922.

En otras palabras, la concentración micelar crítica, es la mínima concentración a la cual, aunque se incremente la concentración de soluto, ya no hay cambio en la tensión superficial del líquido o alguna propiedad coligativa. También puede ser vista como la concentración máxima de soluto de forma monomérica y de película interfacial, o como la concentración mínima requerida de tensoactivo para generar las estructuras autoensambladas.

Ejemplos de tensoactivos en agua:

Tensoactivo                                    CMC a 25 ºC (mM)

Brij 35                                                        0.09

Bromuro de cetiltrimetilamonio (CTAB)    1

CHAPS                                                      8-10

Dodecilsulfato de sodio                             6-10

NP-40                                                        0.05-0.3

Triton X-100                                             0.2-0.9

Tween 20                                                   0.06

Tween 80                                                   0.012

Así, estos tensoactivos generan estructuras en la interfase y en el bulk. Small, en 1968 publicó un artículo sobre la clasificación de lípidos biológicos según su interaccion con el agua (Small, DM. 1968. A Classification of Biological Lipids based upon their interaction in aqueous systems, J. Am. Oil Chem. Soc. 45:108-119). De ahí que el concepto de que los lípidos "son insolubles en agua" no es totalmente cierto, pues pueden quedar de manera monomérica aunque sea a concentraciones inferiores al CMC. Pero además no todos pueden generar estructuras ensambladas, y aún los que lo generan, no siempre se generan micelas, hay otras estructuras como la lamela, la fase hexagonal y la fase cúbica bicontinua, por mencionar algunas.

Clasificación de Small

La clasificación de Small (Small, 1968) toma en cuenta la capacidad de los lípidos de generar autoensambles, si son o no anfifílicos. Antes de eso, usaremos la representación esquemática del autor:

En esta representación:

1) molécula general anfifílica

2) ácido graso protonado de cadena larga

3) colesterol (esterol y derivados)

4) lecitina o fosfatidilcolina: lípido con ambas cargas positiva y negativa (llamado zwitteriónico)

5) lisolecitina

6) ácido graso ionizado

7) sal biliar

Quiz: ¿Por qué la lisolecitina se parece a la lecitina pero solo se le puso una "cola" hidrofóbica en lugar de dos?

La clasificación es como sigue

Lípidos no polares. Lípidos que no contienen porciones polares. No generan estructuras autoensambladas ni capas en la interface. Ejemplos: hidrocarburos aromáticos policíclicos como benzopireno, pireno. 

Lípidos polares. Lípidos que contienen porciones polares. Se clasifican en:

I. Lípidos anfifílicos insolubles en agua no autoensamblables. Lípidos que aunque tienen porción polar, pueden estar como monómero en el bulk, o generar una monocapa estable en la interface Ejemplos: ceras, di- y triacilglicéridos, ácidos grasos protonados de cadena larga, ésteres de esteroles, alcoholes de cadena larga como el fitol y retinol, Vitaminas liposolubles (A, D, E y K), y otros esteroles. 

II. Lípidos anfifílicos insolubles autoensamblables. Lípidos que contienen porciones polares, que pueden estar como monómero pero además pueden autoensamblarse a concentraciones mayores que la CMC, generando líquidos cristalinos en el bulk. En la interface, generan una monocapa estable. Ejemplos: monoglicéridos, ácidos grasos disociados (saponificados), ácido fosfatídico y otros fosfolípidos como lecitinas, encefalinas, fosfatidilinositol, esfingomielina, esfingolípidos, cerebrósidos, fosfatidilserina, plasmalógenos, cardiolipinas y sulfolípidos.

III. Lípidos anfifílicos. La porción hidrofílica tiene alto carácter polar, por lo que la porción hidrofílica contrasta claramente con la hidrofóbica, pero terminan siendo solubles. Pueden generar estructuras autoensambladas pero no estables y en la interface generan películas que son también inestables.  Estos a su vez, se dividen en:

A) Lípidos anfifílicos con mesomorfismo liotrópico. En el bulk, generan cristales líquidos a alta concentración y micelas. Se llama mesomorfismo liotrópico porque no la estructura no es estable (mesomorfismo) y además, depende y se orienta según el solvente en el que se encuentre (liotrópico). Ejemplos: lisolecitinas y otros detergentes aniónicos, catiónicos y no iónicos como el SDS, CTAB, Tritón y Brij.

B) Lípidos anfifílicos sin mesomorfismo liotrópico. No generan líquidos cristalinos en agua, generan micelas inestables, así como las películas en interface que también son inestables. Ejemplos: sales biliares, ácidos fenantrensulfónicos, saponinas y lípidos cardiotónicos, entre otros.

Estructuras autoensambladas

Como mencionaba arriba, los lípidos autoensamblables generan diferentes tipos de estructura, estas fueron revisadas por Goñi en 2014.

(Tomada de Goñi, 2014)

Lα, Lβ y Pβ pertenecen a una misma estructura llamada lamela, que se refiere a una bicapa donde la parte hidrofóbica se encuentra en el centro, y las porciones hidrofílicas en el exterior. Cuando se encuentra compacta, con interacciones hidrofóbicas de las colas lipídicas y casi "plana", se le conoce como fase gel o Lβ; cuando las colas lipídicas no tienen tanta interacción, y hay más espacio entre ellas (no está tan empaquetada como la fase gel) se le conoce como fase líquido cristalino o Lα. En ambos casos, la lamela es "plana" pero en algunos casos, puede generar protuberancias o ángulos, esta fase se conoce como fase ripple (rugosa como ruffle) o Pβ. De hecho, se puede la fase gel se puede convertir a fase ripple y a líquido cristalino mediante el incremento de temperatura, temperatura a la cual se le llama Temperatura de transición.

La micela de "core" o interior hidrofóbico y exterior hidrofílico se le conoce como M.

La fase hexagonal, consta de tubos puestos uno sobre otro (como cuando apilas tubos). Esta fase hexagonal tiene el interior "vacío" donde puede acomodarse solvente. Si el solvente es el agua, entonces el tubo tiene a los lípidos a lo largo del tubo con la porción hidrofílica orientada hacia el interior y la porción hidrofóbica hacia fuera del tubo interaccionando con las otras colas hidrofóbicas de los lípidos en los otros tubos. A esta se le llama fase hexagonal II, o fase hexagonal invertida o HII. Si el solvente fuera cloroformo, las porción hidrofóbica estaría orientada hacia el interior del tubo y la hidrofílica hacia el exterior, es decir, al revés de la HII, esta se llama fase hexagonal o HI. 

Estos tubos pueden interconectarse, en lugar de estar alineados como la fase hexagonal. Cuando se interconectan, pueden generar patrones laberínticos que se repiten en patrones complejos cúbicos. Estos laberintos pueden estar continuos o simplemente dejar cuartos aislados en los laberintos, es decir, no ser continuos. En ambos casos, el interior tiene orientadas las porciones hidrofílicas de los lípidos, mientras que las porciones hidrofóbicas serían los muros de los laberintos, por lo que se llaman fases cúbicas invertidas QII. Estas fases son llamadas fase cúbica bicontinua o fase Q224 y fase cúbica Q227. Hay otras fáses cúbicas más, pero estas son las más conocidas.

Este último, es un dibujo de la fase Q224.

Todas estas fases se estabilizan gracias a las interacciones hidrofóbicas de las cadenas, que permiten interactuar entre ellas. Pero ¿de dónde sale la energía para que puedan interactuar? ¿cómo es que parece generarse orden espontáneamente, cuando la entropía de un sistema siempre favorece el desorden?

Recordemos que la energías de las interacciones entre moléculas o átomos son:

Energía de unión (BE) para el enlace iónico:

Para la interacción ion-dipolo

Para la interacción dipolo-dipolo(donde o=1 si los dipolos están en antiparalelo, y 2 si están encontrados colinealmente)

Para las interacciones de London: (donde I es la energía de ionización de la molécula polarizable, α es una constante de polarizabilidad)

Como puedes notar, la energía de la interacción va disminuyendo con la fuerza, las de London, consideran que la molécula sería polarizable, es decir, se referiría a un dipolo parcial momentáneo inducido, pero sin llegar a ser dipolo como tal. En todos estos casos, puedes ver claramente que se aplica un cambio de fuerzas (eléctricas o magnéticas) pero entre la interacción hidrofóbica, no se debe a una entalpía de enlace puesto que no hay electrones compartidos ni campos de fuerzas aplicados. De hecho, es característico, porque cuando depende de campos de fuerza, siempre la distancia entre moléculas (r) está implicada en la energía y decae con un exponente n (exponente de r), dependiendo de la fuerza de la interacción, en iónica, es 1, en ion dipolo n=2, en dipolo-dipolo es 3 y en inducible es 4, en la repulsión entre núcleos n va de 5 a 10, de ahí el factor de corrección por repulsión en la ecuación de Coulomb : (1-1/n) en la energía del enlace iónico.

Quiz: considerando que el sodio +1 tiene un radio iónico de 0.095 nm y el cloro -1 de 0.099. ¿Cuál sería la energía de unión del cloruro de sodio si la n de repulsión es de 10? Recuerda que ε0=8.854187x10^-12 C/V.m

Quiz: ¿Cuál sería la fuerza de interación ion-dipolo entre el ion cloro -1 y el agua (momento magnético μ de 1.85 D si están distanciados alrededor de 0.28 nm? 

De esta manera, la energía libre en la interacción hidrofóbica no depende de la entalpía de enlace o campo, sino que dependerá de la entropía en la interacción entre las moléculas. ΔG=-TΔS.

 .........(Ecuación 1)

La interacción dependerá de los estados de dichas moléculas. Cuando las moléculas están estructuradas, su volumen molecular es bajo, pero a medida que se desordenan el volumen molecular se incrementa y por tanto su densidad disminuye. La Ecuación 1, se refiere al cambio de entropía entre dos estados de desorden molecular (ρ2 y  ρ1), siendo ρ0 el estado más estable (de menor energía) de las moléculas. Cuando el estado 2 es más desordenado que el 1, su proporción ρ0/ρ1 es mayor, y por tanto, el ΔS se vuelve más negativo. Eso implica que un estado más desordenado donde las moléculas tiene mayor volumen molecular, se encuentra favorecido entrópicamente.

En los lípidos, el volumen molecular de los monómeros es mayor que en las estructuras autoensambladas, así los monómeros son más estables (y los primeros en presentarse) que las estructuras autoensambladas. Mientras más empaquetada la estructura, es menos estable, de ahí que cuando se aplica calor, el volumen molecular tiende a incrementarse. Entonces, si la estructura autoensamblada tiene menor volumen molecular, por qué es estable?

Bueno, la razón ya se conoce desde hace tiempo y es que esas estructuras no son sistemas aislados, se encuentran en un solvente: el agua. El agua, también se encuentra estructurada, si bien repelen la porción hidrofóbica de los lípidos, estos pueden empaquetarse, generando un volumen mayor (dentro del agua) disminuyendo la estructuración del agua y por tanto incrementando el volumen molecular del agua que rodea a dichas estructuras. En pocas palabras, la energía entrópica (de desorden) que propicia el autoensamblado viene de las moléculas del agua, y no de las moléculas del lípido. El desorden se incrementa en el sistema, pero es debido al desorden de las moléculas del agua y no las del lípido. Así que podemos decir, que más que autoensambladas, son hidroensambladas. 

Quiz: ¿Crees que las estructuras autoensambladas se generarían en otro solvente?

Y cómo es que eso no ocurre con todos los lípidos. Bueno, porque depende de que se puedan empaquetar adecuadamente (en un patrón repetido), moléculas como el colesterol por sí solo, no tienen una superficie que les permita empaquetarse, pero sí los ácidos grasos o cadenas semejantes. De ahí que todos los lípidos que generan estructuras autoensambladas tienen cadenas repetidas que pueden interaccionar con otra igual. La estructura autoensamblada dependerá de la forma del lípido que permite su propio empaquetamiento:

(Tomado de Goñi, 2014)

Así que si su forma es cónica, tienden a generar curvaturas (como los ácidos grasos disociados), mientras que si la forma es cilíndrica tienden a generar estructuras más planas, como la fosfatidilcolina.

Así, se conoce que la fosfatidilcolina puede generar estructuras de curvatura menos pronunciada "casi plana" como los lamelas, o bicapa lipídica, que son la base de la membrana biológica y los liposomas.

La membrana biológica

Hasta antes de 1972, se asumía que el modelo era tipo micela o lamela y se sabía que había proteínas "adosadas" a la membrana, pero no se sabía si esas proteínas interaccionaban con la parte polar de la bicapa lipídica (A, modelo Danielli-Davson), pero esto no explicaba porque era difícil separarlas y cómo es que algunas otras moléculas lipídicas se podían anclar, para ello debían atravesar la capa proteíca. El modelo de Singer-Nicolson en 1972 propuso que las proteínas podían estar inmersas en un bicapa, dejando área de lípidos y de proteínas en la membrana (B de la siguiente figura).

(Tomado de Goñi, 2014)

En el modelo de Singer & Nicolson, los lípidos estan en una bicapa, y que las proteínas están inmersas y que podían atravesarla (proteínas integrales o intrínsecas) o solo estar de un lado (proteínas periféricas o extrínsecas) de la bicapa. Ambos los lípidos y proteínas podían difundir o "moverse" lateralmente en la membrana, razón por la cual al modelo se le llama "mosaico fluido". La velocidad de difusión lateral es de 10^-8 a 10^-9 cm2/s para lípidos y 10-9 a 10-11 cm2/s para proteínas integrales. Pero la posibilidad de que un lípido de una cara de la bicapa pasara al otro lado era minúscula o nula. De esta manera, la cara de un lado de la membrana no es igual a la otra, por lo que se le llama asimétrica.

Quiz: ¿Qué evidencias científicas hay de que es fluida la membrana?

En la actualidad, sabemos que los lípidos y las proteínas pueden rotar a lo largo de la membrana (de un lado a otro) a una velocidad de 10^8 - 10^9 eventos/s (para lípido) y 10^3 a 10^5 eventos/s (para proteína), que no se explicaba en el modelo de Singer & Nicolson (A de la siguiente figura). Con el modelo actual, propuesto por Engelman (B de la siguiente figura), se han hecho varias adecuaciones al modelo 

(Tomado de Goñi, 2014)

1) La frecuencia de proteínas integrales es mucho mayor de lo que se pensaba. En algunos casos, la densidad superficial de las proteínas puede igual o superar a la de los lípidos.

2) Proteínas pueden separarse o anclarse a la membrana dependiendo de cambios conformacionales, como si las proteínas fueran "visitantes" en la membrana.

3) No siempre están como fase líquido cristalino, sino que puede haber otras fases temporalmente.

4) Las membranas no son "casi planas" sino que están curvadas y esta curvatura depende de las propiedades de lípidos y proteínas.

5) Hay heterogeneidad lateral, puede haber parches o dominios de 0.1 a 1 μm de diámetro en la membrana que además tienen una función biológica. Se ha acumulado evidencia experimental de los rafts (de 10-200 nm de diámetro), propuestos por Simons e Ikonen en 1997. La duración de su existencia de 100 ms es efímera en términos macroscópicos pero larga en términos microscópicos.

6) Puede haber cambio de una cara a otra ("flip-flop"), además del lateral. Estos movimientos de "scrambling" además tienen una función celular, como en la apoptosis, de ahí que no es de extrañar que haya enzimas que cumplen dicha función para mantener la asimetría membranal.